Germany
November 8, 2012
A phosphate switch to fine-tune the protein production in the cells
MicroRNAs are essential regulators of the genetic program in multicellular organisms. Because of their potent effects, the production of these small regulators has itself to be tightly controlled. That is the key finding of a new study performed by Tübingen scientists at the Max Planck Institute for Developmental Biology. They identified a new component that modulates the production of micro RNAs in thale cress, Arabidopsis thaliana, by the removal of phosphate residues from a micro RNA-biogenesis enzyme. This can be as quick as the turn of a switch, allowing the plant to adapt to changing conditions. In this study, the scientists combined advanced imaging for facile detection of plants with defective microRNA activity with whole genome sequencing for rapid identification of new mutations.
The thale cress, Arabidopsis thaliana - © MPI for Developmental Biology
The cell seems to thwart itself: Reading the DNA, a mobile messenger RNA is produced in the cell nucleus, exported to the cytoplasm where it serves as a blueprint for the production of proteins. At the same time, the cell is able to produce micro RNAs that, by binding to specific messenger RNAs, can block protein production or even initiate its destruction. But why does the cell start a costly process and immediately stops it? "Well, the answer lies on the fine balance the cell has to achieve between producing a protein and avoid having an excess of it. Reaching the right level of a protein and its adequate temporal and spatial distribution requires, sometimes, opposed forces," says Pablo Manavella, first author of the study and postdoc in the department of Detlef Weigel at the Max Planck Institute for Developmental Biology. "Once the transcript of the messenger RNA is activated it is quite stable. If you need a quick stop, regulatory mechanisms, such as the micro RNAs, will be able to hold up the process," he explains. The study was carried out in collaboration with scientists from the Center for Plant Molecular Biology (ZMBP) and the Proteome Center of the University of Tübingen.
The production of micro RNAs from its precursors has already been extensively studied, especially in animal cells. "Micro RNAs in plants have evolved in parallel and independently. We had to assume that they could be processed in a different way," Pablo Manavella explains.
The scientists used a methodical trick to study the activity of micro RNAs in cells of thale cress plants. First, they developed a reporter system based on the bioluminescent protein luciferase from firefly; its DNA was integrated in the plant cells. Secondly, the scientists inserted in the plant genome a fragment of DNA containing a precursor of an artificial micro RNA that specifically inhibits luciferase. These plants thus initially showed no light emission despite containing the genes encoding luciferase. In a mass experiment, the scientists then triggered unspecific mutations in thousands of plants. With the aid of a special hypersensitive camera the few shining plants were sorted out. "In all these individuals some part of the micro RNA pathway must have been damaged so that luciferase was no longer silenced by the artificial micro RNA," says Pablo Manavella.
To identify the genes responsible for the failure in silencing luciferase, the scientists made use of a new technology developed at the Max Planck Institute, which enables the rapid detection of causal mutations by whole-genome sequence analysis. "Just a few years ago, this project would have been difficult to complete within two years. Nowadays, whole genome sequencing is a rapid and affordable method. By combining the screening test on luciferase activity with whole genome sequencing we could reduce the study period from years to several months," Pablo Manavella explains. Among the obtained mutants the scientists identified the phosphatase CPL1 as a key component of the microRNA biogenesis pathway. This protein modulates the production of these molecules by removing phosphate residues from HYL1, one of the main co-factors in the pathway, impairing the production of micro RNAs. Once produced these micro RNAs will bind to the corresponding messenger RNAs stopping the production of the protein.
"We have identified one factor able to regulate the activity of the regulators," Pablo Manavella summarizes their results. Micro RNAs represent only one of the of genetic regulation mechanisms among many others; however, in the manner of a switch they provide quick and efficient answers to changing requirements, for example in many developmental processes. In general, micro RNAs in plants are much more specific than in animals, the scientists say. "Plants cannot run away when facing a stressful condition. Therefore they need quick ways to regulate its genes in order to adapt to such situations."
Mikro-RNAs in Pflanzen: Auch Regulatoren müssen reguliert werden
Ein Phosphatschalter sorgt für die Feinabstimmung bei der Proteinherstellung
Mikro-RNAs greifen bei Vielzellern entscheidend in die Genregulation ein. Da diese Regulatoren hochwirksam sind, müssen sie selbst sehr genau reguliert werden. Das haben Tübinger Forscher des Max-Planck-Instituts für Entwicklungsbiologie in einer neuen Studie festgestellt. Sie identifizierten in der Ackerschmalwand, Arabidopsis thaliana, eine bisher unbekannte Komponente, die durch das gezielte Entfernen eines Phosphatrests die Herstellung von Mikro-RNAs steuert. Das geht so schnell wie das Umlegen eines Schalters, so dass sich die Pflanze zügig an wechselnde Bedingungen anpassen kann. Entscheidend bei diesen Untersuchungen waren am Max-Planck-Institut entwickelte Verfahren, die es erlauben, induzierte Mutationen innerhalb weniger Tage durch Analyse des gesamten Pflanzengenoms aufzuspüren.
Die Ackerschmalwand, Arabidopsis thaliana - © MPI für Entwicklungsbiologie
Es wirkt, als bremse sich die Zelle selbst aus: Beim Ablesen der DNA im Zellkern wird eine mobile Boten-RNA hergestellt, die ins Zellplasma exportiert wird und dort als Bauplan für die Herstellung von Proteinen dient. Gleichzeitig kann die Zelle Mikro-RNAs produzieren, die sich spezifisch an eine bestimmte Boten-RNA anlagern; sie hemmen die Proteinherstellung oder leiten sogar den Abbau der Boten-RNA ein. Doch wozu beginnt die Zelle einen aufwendigen Prozess, den sie gleich wieder stoppt? „Die Zelle muss genau die Balance halten, sie muss ein Protein in ausreichender Menge herstellen, aber Überproduktion vermeiden. Um die richtige Menge in der richtigen Zeit und an der richtigen Stelle verfügbar zu haben, braucht sie teilweise gegeneinander arbeitende Kräfte“, sagt Pablo Manavella, Erstautor der Studie und Postdoktorand in der Abteilung von Direktor Detlef Weigel am Max-Planck-Institut für Entwicklungsbiologie. „Einmal aktiviert, ist die Boten-RNA sehr stabil. Wenn sie zur Regulierung schnell gestoppt werden muss, können starke Gegenspieler wie Mikro-RNAs die weiteren Prozesse aufhalten.“ Die Studie entstand in Zusammenarbeit mit Forschern vom Zentrum für Molekularbiologie der Pflanzen (ZMBP) und dem Proteom-Centrum der Universität Tübingen.
Die Bildung der Mikro-RNAs aus Vorläufern ist vor allem bei tierischen Zellen ausführlich untersucht worden. „In der Evolution haben sich Mikro-RNAs jedoch bei Pflanzen parallel unabhängig davon entwickelt. Daher war anzunehmen, dass sich die Abläufe unterscheiden“, sagt Pablo Manavella. Um die Synthese aktiver Mikro-RNAs in Zellen der Ackerschmalwand zu verfolgen, haben die Forscher methodisch zu einem Trick gegriffen. Sie entwickelten zunächst ein Reportersystem bestehend aus dem Protein Luciferase des Leuchtkäfers, das ein grünes Leuchten erzeugen kann, und einer künstlichen Mikro-RNA, die gezielt die Produktion der Luciferase hemmt. Beide Komponenten wurden in den DNA-Bauplan der Pflanzenzellen eingeschleust, daher war zunächst kein Leuchten zu beobachten. In einem Massenverfahren lösten die Forscher dann in Tausenden von Pflanzen ungezielt Genveränderungen aus. Mit Hilfe einer speziellen, hochempfindlichen Kamera suchten sie die wenigen leuchtenden Pflanzen heraus. „In diesen mutanten Individuen musste irgendein Teil des Luciferase-Reportersystems geschädigt sein, sodass die Luciferase nicht mehr durch die künstliche Mikro-RNA gehemmt wurde“, sagt Pablo Manavella.
Um die Gene zu identifizieren, die für die ausbleibende Hemmung der Luciferase verantwortlich waren, wurde ein neues, am Max-Planck-Institut entwickeltes Verfahren angewandt, mit dem innerhalb von Tagen induzierte Mutationen im Erbgut aufgespürt werden können. „Vor einigen Jahren wäre das nicht denkbar gewesen. Heute sind Genomanalysen schnell und preisgünstig zu machen. Mit der kombinierten Untersuchung von Luciferase-Screeningtest und Genomanalyse konnten wir die Studiendauer von Jahren auf wenige Monate verkürzen“, erklärt Pablo Manavella. Die Forscher identifizierten in den mutanten Pflanzen die Phosphatase CPL1 als Schlüsselkomponente in der Verarbeitung der Mikro-RNAs. Dieses Protein moduliert die Mikro-RNA-Produktion, indem es Phosphatreste von HYL1 entfernt, das daraufhin die Fertigstellung der Mikro-RNAs bewirkt. Diese lagern sich an ihre jeweils entsprechende Boten-RNA an und unterbinden so die Herstellung des Proteins.
„Wir haben einen Faktor gefunden, der die Verfügbarkeit des Regulators reguliert“, fasst Pablo Manavella die Ergebnisse zusammen. Mikro-RNAs seien zwar nur ein Genregulationsmechanismus unter vielen, lieferten aber wie ein Schalter eine besonders schnelle und effiziente Antwort auf geänderte Anforderungen, zum Beispiel bei vielen Entwicklungsprozessen. Generell seien Mikro-RNAs bei Pflanzen sehr viel spezifischer als bei Tieren. „Pflanzen können in einer Stresssituation nicht weglaufen. Daher brauchen sie schnelle Regulationsmöglichkeiten, um richtig zu reagieren.“
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