Germany
March 4, 2020
CRISPR-Cas9 has revolutionized the field of genetics by its ability to cut DNA at defined target sites. Researchers are using the Cas9 enzyme to specifically switch off genes, or insert new DNA fragments into the genome. But no matter how specific the Cas9 enzyme is – sometimes it cuts where it shouldn’t. Scientists at the Max Planck Unit for the Science of Pathogens in Berlin and the Faculty of Medicine of the Martin Luther University Halle-Wittenberg now report a Cas9 variant that increases the specificity of genome editing.
Structure of Cas9 bound to single guide RNA (scaffold in dark gray, spacer in yellow) and DNA target strand (purple). Changing the amino acid residue Q768 (orange, dashed box) yields a mor specific Cas9 variant - © Bratovic et al., 2020
In order for Cas9 to cut a DNA target, it needs to be directed to the target site by what is called a guide RNA. The guide RNA contains the complementary sequence to the DNA target site, working like a ZIP Code to guide Cas9 to its target. "Sometimes, however, Cas9 can also cut DNA sequences that are very similar to the actual target, known as off-targets," explains Emmanuelle Charpentier, director of the Max Planck Unit for the Science of Pathogens.
This undesired activity of CRISPR-Cas9 can lead to inaccuracies in genome editing. "An unintended cut at the wrong place in the human genome can have profound consequences. That is why we need a more specific system," says Michael Böttcher, Assistant Professor at the Medical Faculty of the Martin Luther University.
Scientists are therefore trying to optimize Cas9 specificity using different approaches. In the current study, the team of researchers from Berlin and Halle focused on an evolutionarily conserved domain of Cas9, known as bridge helix.
Amino acids form stable loop
The researchers found that the bridge helix plays a critical role in the mechanism by which Cas9 interacts with its guide RNA and DNA target site. They identified a group of amino acid residues that make contact with the phosphate backbone of the guide RNA, thereby facilitating the formation of a stable loop, which is essential for the activity of Cas9. In such a loop, the Cas9-bound guide RNA pairs with the complementary strand of the DNA target sequence while displacing the second DNA strand, thereby enabling Cas9 to cut both DNA strands.
The researchers generated new Cas9 variants by changing these amino acid residues and found that several variants cut much less frequently at off-target sites than the original Cas9 enzyme. They further show that one of the identified variants, called R63A/Q768A, increased the gene editing specificity of Cas9 also in human cells. "Our results provide a new basis for further optimization of CRISPR-Cas9. They demonstrate the need to gain more knowledge about the biochemistry of CRISPR-Cas systems to further improve them", says Charpentier.
Original publication
Bratovic M*, Fonfara I*, Chylinski K, Galvez EJC, Sullivan TJ, Boerno S, Timmermann B, Boettcher M and Charpentier E. *Gleicher Beitrag
Bridge Helix Arginines Play a Critical Role in Cas9 Sensitivity to Mismatches.
Nat. Chem. Biol.; 2 March, 2020
Neue Cas9-Variante macht Genom-Editierung noch präziser - Forschende in Berlin und Halle haben eine spezifischere CRISPR-Cas9 Genschere entwickelt
CRISPR-Cas9 kann DNA spezifisch an definierten Stellen schneiden und hat damit die Genetik revolutioniert. Forscher benutzen die sogenannte Genschere unter anderem dazu, Gene gezielt auszuschalten oder neue DNA Fragmente in das Genom einzufügen. Aber egal wie spezifisch das Cas9-Enzym ist - manchmal schneidet es dort, wo es nicht schneiden soll. Wissenschaftler der Max-Planck-Forschungsstelle für die Wissenschaft der Pathogene in Berlin und der Medizinischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg haben nun eine Cas9-Variante entwickelt, die die Editierung von Genen noch spezifischer macht.
Damit Cas9 sein DNA Ziel schneiden kann, muss es zunächst durch eine so genannte “guide-RNA” an die Stelle im Genom geleitet werden, an der es schneiden soll. Die guide-RNA enthält die zur Zielstelle komplementäre Sequenz und funktioniert wie eine Postleitzahl, die Cas9 an sein Ziel bringt. "Manchmal kann Cas9 jedoch auch DNA-Sequenzen schneiden, die dem eigentlichen Ziel sehr ähnlich sind, so genannte Off-Targets", erklärt Emmanuelle Charpentier, Direktorin der Max-Planck-Forschungsstelle für die Wissenschaft der Pathogene.
Diese unerwünschte Aktivität von CRISPR-Cas9 kann zu Ungenauigkeiten bei der Bearbeitung des Genoms führen. "Ein unbeabsichtigter Schnitt an der falschen Stelle im menschlichen Genom kann tiefgreifende Folgen haben. Deshalb brauchen wir ein spezifischeres System", sagt Michael Böttcher, Juniorprofessor an der Medizinischen Fakultät der Martin-Luther-Universität.
Wissenschaftler versuchen daher, die Spezifität von Cas9 mit verschiedensten Ansätzen zu optimieren. In der aktuellen Studie konzentrierte sich das Forscherteam aus Berlin und Halle auf eine evolutionär konservierte Domäne von Cas9, die so genannte Brückenhelix.
Aminosäuren bilden stabile Schleife
Die Forscher haben herausgefunden, dass die Brückenhelix eine entscheidende Rolle bei dem Mechanismus spielt, durch den Cas9 mit seiner guide-RNA und der DNA Zielstelle interagiert. Sie identifizierten eine Gruppe von Aminosäuren, die mit dem Phosphat-Rückgrat der guide-RNA in Kontakt kommen und dadurch die Bildung einer stabilen Schleife ermöglichen, die für die Aktivität von Cas9 essentiell ist. In dieser Schleife paaren sich die Basen der von Cas9-gebundenen guide-RNA mit dem komplementären Strang der DNA-Zielsequenz und verdrängen dabei den zweiten DNA-Strang. Dadurch kann Cas9 beide DNA Stränge schneiden.
Die Forscher haben die identifizierten Aminosäuren verändert und so neue Cas9-Varianten entwickelt. Dabei haben sie festgestellt, dass mehrere dieser Varianten viel seltener als das ursprüngliche Cas9-Enzym an Stellen schneiden, die nicht der eigentlichen Ziel-DNA entsprechen. Eine der getesteten Varianten, genannt R63A/Q768A, erhöht die Spezifität von Cas9 auch in menschlichen Zellen. "Unsere Ergebnisse bieten eine neue Grundlage für die weitere Optimierung von CRISPR-Cas9. Darüber hinaus müssen wir mehr über die Biochemie der CRISPR-Cas-Systeme lernen, damit wir sie weiter verbessern können", sagt Charpentier.
Originalpublikation:
Bratovic M*, Fonfara I*, Chylinski K, Galvez EJC, Sullivan TJ, Boerno S, Timmermann B, Boettcher M and Charpentier E. *Gleicher Beitrag
Bridge Helix Arginines Play a Critical Role in Cas9 Sensitivity to Mismatches.
Nat. Chem. Biol.; 2. März 2020
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